XMRV en los países bajos
Publicado: 01 Mar 2010, 21:11
Demasiado complicado para mí...no sé si vosotros entendéis algo.
lo único que sé, es que también a salido negativo para "XMRV" en el SFC.
Publicado el 25 de febrero de 2010, doi: 10.1136/bmj.c1018
Lo citan como: BMJ 2010; 340: C1018
Investigación
Prevalencia de xenotropic virus de la leucemia murina-virus relacionados en los pacientes con síndrome de fatiga crónica en los Países Bajos: análisis retrospectivo de muestras de una cohorte establecido
Frank J M van Kuppeveld, profesor asociado de la virología experimental de1, 5, 6, Arjan de Jong S, microbiólogo médico molecular1, 5, Kjerstin H Lanke, técnico de investigación1, 5, 6, Gerald W Verhaegh, investigador senior2, 6, Willem J G Melchers, microbiólogo médico molecular1, 5, 6, Caroline M A Swanink, microbiólogo médico1, Gijs Bleijenberg, profesor de psicología de4, 5, 7, Mihai G Netea, experimental, profesor de medicina interna3, 5, Jochem M D Galama, profesor de virología clínica1, 5, W M Jos van der Meer, profesor de medicina interna de3, 5
1 Departamento de Microbiología Médica, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 6500 HB Nijmegen, Países Bajos, 2 Departamento de Urología, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 3 Departamento de Medicina Interna, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 4 Centro de Expertos de Fatiga Crónica, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 5 Nijmegen Instituto para la infección, la inflamación y la inmunidad, Nijmegen, 6 Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Nijmegen, 7 Nijmegen Centre for Evidence Based Practice, Nijmegen
Correspondencia a: J F M van Kuppeveld f.vankuppeveld @ ncmls.ru.nl
Resumen
Resumen
Introducción
Métodos
Resultados
Discusión
Referencias
Objetivo La presencia del retrovirus de la leucemia murina xenotropic virus virus relacionado (XMRV) ha sido reportado en la sangre periférica las células mononucleares de pacientes con síndrome de fatiga crónica. Teniendo en cuenta la importancia médica y social potencialmente grande de tal descubrimiento, se investigó si este hallazgo puede ser confirmada en una cohorte europea independiente de los pacientes con El síndrome de fatiga crónica.
Diseñar Análisis de una cohorte bien definida de los pacientes y acertaron los controles del vecindario mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Escenario Certificado (ISO 15189) laboratorio de virología clínica en un hospital universitario en los Países Bajos.
Población Entre diciembre de 1991 y abril de 1992, periféricas células mononucleares de sangre fueron aisladas de 76 pacientes y 69 los controles del vecindario emparejado. En este estudio se probaron las células de 32 pacientes y 43 controles de quienes original criopreservados frascos estaban todavía disponibles.
Principales medidas de resultado Detección de XMRV en sangre periférica de células mononucleares de ensayo real del tiempo de reacción en cadena de la polimerasa la orientación de la XMRV de la integrasa genes y / o de la polimerasa anidada ensayo de reacción en cadena de la orientación de la XMRV gag gen.
Resultados No se detectaron XMRV secuencias en ninguno de los pacientes o los controles en ninguno de los ensayos, en la que positivo en la materia y los controles negativos de aislamiento y la reacción en cadena de la polimerasa controles. Experimentos con muestras enriquecidas mostraron que éramos capaz de detectar al menos 10 copias de secuencias de XMRV por 105 las células mononucleares de sangre periférica por el tiempo real, así como por anidada de reacción en cadena de la polimerasa, demostrando una alta sensibilidad de ambos ensayos.
Conclusiones Este estudio no pudo demostrar la presencia de XMRV en la células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedades crónicas El síndrome de fatiga de una cohorte neerlandés. Estos datos ponen en duda sobre la afirmación de que XMRV está asociada con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes.
Introducción
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Referencias
Síndrome de fatiga crónica, también llamada encefalitis miálgica, es caracteriza por desactivar la fatiga física y mental, duradera durante al menos seis meses, sin una causa física aparente.1 2 3 El sello distintivo de la enfermedad es la fatiga debilitante, pero síntomas como mialgia, interrupción del sueño, dificultades de concentración, dolor de garganta, linfadenopatía y también pueden estar presentes, aunque de más variable. Más de dos tercios de los pacientes son mujeres. Aunque se desconoce la causa y la enfermedad puede abarcar más de un entidad, muchos han sugerido que los agentes infecciosos tienen un papel.4 De hecho, la aparición del síndrome de fatiga crónica es a menudo precedida por una gripe aguda como una enfermedad o la mononucleosis infecciosa, con aparentemente deterioro de recuperación.5 El papel de la infección crónica y la cambiado la inmunidad se ha postulado. La mayoría de los casos de la enfermedad son esporádicos, pero en algunos casos agrupados se han descrito, en particular, lo que sugiere una causa infecciosa. Sin embargo, a pesar de amplios estudios, ningún agente infeccioso causante ha sido concluyente identificados, ni un defecto inmunológico ha sido establecido para explicar los síntomas.2 6
En una publicación reciente en Ciencia, Lombardi, et al7 informó xenotropic la detección de virus de la leucemia murina-virus relacionado (XMRV)-gamma de un retrovirus humano que fue identificado por primera vez en el tejido tumoral de los pacientes con cáncer de próstata8En células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedades crónicas El síndrome de la fatiga. En ese estudio, XMRV fue detectado por la polimerasa de reacción en cadena en el 67% de los pacientes (68 de 101 muestras) y en el 4% de los individuos sanos (ocho de 213 muestras). Además, anticuerpos XMRV fueron identificados en la sangre de los pacientes pero no en los controles. Lombardi et al mostraron que XMRV era contagioso y de transmisión de material clínico de los pacientes a las células T las culturas y una línea celular permisiva. La secuencia genética de XMRV en los pacientes fue casi idéntica a la que en los pacientes con el cáncer de próstata, lo que indica que el retrovirus identificado es de un virus humano genuino en lugar de un ratón de contaminación de virus de la leucemia.
Este informe fue considerado un gran avance científico y llamó mucho la atención. Sin embargo, el documento quedó corto en la descripción de los pacientes: ¿Cuál fue la naturaleza de la cohorte, lo que fue la distribución por edad y sexo, que tan bien se los controles de la misma? De investigación de una cohorte independiente de tanto, es necesario antes de una asociación causal entre XMRV la infección y el desarrollo del síndrome de fatiga crónica puede determinarse. Se investigó la presencia de XMRV en la una cohorte neerlandés bien establecida de pacientes con fatiga crónica El síndrome de utilizar en tiempo real se ha descrito anteriormente y de la polimerasa anidada ensayos de reacción en cadena en dos genes diana diferente.7 8 9
Métodos
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Cohorte de pacientes
Todos los pacientes y los controles examinados en este estudio se parte de la de una cohorte de 298 pacientes neerlandés, que ha sido descrito en detalle.10 11 Todos los pacientes de esta cohorte cumplido el Oxford criterios e informó de fatiga intensa, sin explicación, debilitante de al menos un año de duración.12 La duración media de su los síntomas fue de siete años (rango 2-45 años). Los pacientes incluidos acudieron a la consulta ambulatoria en dos ocasiones en un período de tres meses. En la segunda visita, cada paciente fue acompañada por un barrio de control (que fue seleccionado por el paciente) del mismo sexo y el plazo de dos años de la misma edad. Los pacientes y los controles visitados nuestra clínica entre diciembre de 1991 y abril de 1992. Todos los pacientes realizó un examen físico y un laboratorio de amplio el trabajo y completado una serie de cuestionarios.10 Las muestras de sangre fueron obtenidos de 76 pacientes (seleccionados al azar utilizando una tabla de de números aleatorios10 De las 298 pacientes se describió anteriormente) y 69 controles de vecindad emparejado. Las muestras de sangre fueron enviadas a el laboratorio central del servicio de transfusión de sangre en Amsterdam, donde las células mononucleares de sangre periférica fueron aislados durante un estudio de los tipos de linfocitos y la apoptosis.11 Después del aislamiento, una fracción de las células mononucleares de sangre periférica fue directamente criopreservados de acuerdo con un protocolo estándar en un informático dispositivo. Las células fueron alícuotas en ampollas y se almacena con dimetil 10% sulfóxido a -196 º C (nitrógeno líquido) en una densidad de de alrededor de 107 células por ml. La calidad de las condiciones de almacenamiento en el laboratorio central del servicio de transfusión de sangre quedado ampliamente demostrado por Jansen et al, que demostró que periférica las células mononucleares de la sangre almacenada durante 12 años se mantuvo completamente viable e inmunológicamente competentes.13
En este estudio, se examinaron las células mononucleares de sangre periférica de todos los pacientes (n = 32) y controles (n = 43) de los cuales original viales criopreservados estaban todavía disponibles. Este grupo incluía 25 pacientes y sus controles de la misma, así como siete pacientes y 18 controles que no fueron comparados entre sí. El macho a razón hombre / mujer del grupo de pacientes que se ha probado en este estudio fue de 1:2. La media de edad de los pacientes de sexo masculino fue de 40,7 años (rango 25-61) y de las pacientes fue de 40,5 años (25-67).
El aislamiento de ácidos nucleicos y la síntesis de ADN copia
El ácido nucleico fue aislada a partir de 100 μl de sangre periférica de células mononucleares (alrededor de 0,5 a 2x106 las células) mediante la Magna-Pure LC y la Magna-Pure LC total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnóstico, Almere, Países Bajos), de acuerdo a las instrucciones de del fabricante y eluido en 50 μl de tampón de elución. Un importe fijo de virus del moquillo Focino, un paramixovirus que se utilizó como control interno, se añadieron a las muestras antes de el aislamiento de ácidos nucleicos para que podamos controlar la calidad del ARN y la posible inhibición de la amplificación de las muestras.14 ARN en el ácido nucleico total de los aislamientos se transcripción reversa para de copias de ADN utilizando el kit TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Países Bajos), en un 50 por mezcla de reacción μl con 20 μl de ácidos nucleicos ácido aislar (concentración de 25-150 ng por microlitro) y al azar hexámeros como cartillas, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena de
Un verdadero dúplex tiempo de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa se desarrolló, adaptación de la XMRV de la integrasa real de tiempo de reacción en cadena de la polimerasa ensayo descrito por Schlaberg et al,9 para detectar y XMRV Focino el virus del moquillo simultáneamente. La mezcla de reacción contenía 12,5 μl de 2X LightCycler 480 Sondas Master (Roche Diagnostics), 1 μM de cada primer y 400 Nm de cada sonda, y 5 μl de copias de ADN en un volumen de reacción de 25 microlitros. El XMRV y cebadores Focino virus de moquillo se como se describe.9 14 El XMRV la sonda fue utilizada como 5'-(6-carboxifluoresceína)-etiquetados, bloqueado nucleico sonda de hidrólisis ácida y el virus del moquillo Focino la sonda fue utilizada como 5'-amarillo Yakima-etiquetado, bloqueado nucleicos Sonda de hidrólisis ácida. Todos los primers y sondas utilizadas en este estudio se muestran en la tabla. Condiciones de Ciclismo fueron 95 ° C de cinco minutos, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, y 60 ° C durante 45 segundos utilizando el instrumento LightCycler 480 (Roche Diagnostics). El resultado de la muestra se consideró un resultado válido sólo si el valor del punto de cruce de la aguja el virus del distemper Focino estaba dentro de dos ciclos de la media de de las muestras sin inhibiciones.
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Secuencias de primers y sondas utilizadas en este estudio
Controles positivos y negativos para el aislamiento, la transcripción inversa, y la reacción en cadena de la polimerasa fueron incluidos en cada serie. β-globina real de tiempo de reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo utilizando los cebadores y las sondas de hibridación como se describe.15 Media punto de cruce valor de β-globina tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena de fue 23,84, desviación estándar de 0,95. Como control positivo para el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa, se utilizó el ácido nucleico aislada de 22Rv1, una línea celular de carcinoma de próstata (American Type Culture Colección número CRL-2505) que ha sido recientemente demostrado que contienen múltiples copias integrado de XMRV y producir altos niveles del virus infeccioso.16 Total de aislamiento de ácidos nucleicos y de la muestra la preparación de esta línea celular fue como se describe más arriba para periféricos células mononucleares de sangre.
Para determinar la sensibilidad de la época XMRV real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena, hemos generado a 192 pares de bases XMRV de la integrasa producto de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores XMRV-F2 (que se encuentra aguas arriba de XMRV-F1) y XMRV-R3 (que se encuentra aguas abajo de XMRV-R2), y 22Rv1 de copias de ADN como molde. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa se purificó mediante el Asistente para PCR preps sistema de purificación de ADN (Promega Benelux, Leiden, Países Bajos). La concentración se determinó mediante un Nanodrop 1000 (Thermo Scientific / Isogen, De Meern, Países Bajos) y el número de copias por μl fue calculado. Una serie de diluciones se hizo en el que 101 a 107 copias del calibrador se han añadido a 106 las células mononucleares de sangre periférica antes de ácido nucleico de aislamiento. Esto corresponde a 1 a 106 copias por reacción, ya que una décima parte del ácido nucleico aislada se utilizan como materia prima de la reacción en cadena de la polimerasa, que se realiza como se describe por encima de.
Anidados de reacción en cadena polimerasa
El XMRV gag anidada en cadena polimerasa reacción fue adaptado de Urisman et al.8 Las mezclas de reacción contenía 25 μl de 2X PCR Master (Roche Diagnostics), y 200 nM de cada cebador en un volumen de reacción de 50 microlitros. En la primera reacción, 5 μl de ADN copia se utilizó. Posteriormente, 5 μl de La primera reacción fue utilizada como insumo para la reacción anidada. Cebadores fueron descritas, excepto por el primer revés de la reacción anidada (GAG-IR), que fue sustituido por GAG-I-R2 para producir un producto de 92 pares de base de la reacción (que usamos GAG primer-I-R2 porque se produce menos de fondo en la transcripción inversa anidadas la reacción en cadena de la polimerasa). La secuencia diana de GAG-I-R2 es 100% conserva entre todos los XMRV aislados publicados hasta la fecha (datos no mostrados). Las condiciones de Ciclismo se como se describió anteriormente.8 Productos de la reacción en cadena de la polimerasa (20 microlitro) se analizaron en un 2,5% gel de agarosa.
Para determinar la sensibilidad de nuestra cadena de la polimerasa anidada XMRV ensayo de reacción, 708 pares de bases XMRV gag la reacción en cadena de la polimerasa producto generado utilizando cebadores GAG-UNIQ-F descrito por Dong et al17 (que se encuentra aguas arriba de GAG-DE) y gag-O, y 22Rv1 de copias de ADN como molde. Purificación y determinación de la cantidad de producto de la reacción en cadena de la polimerasa se realizarán según lo descrito anteriormente para la cadena de la polimerasa en tiempo real calibrador de reacción. Una serie de dilución se hizo y el 10 de1 a 107 copias del calibrador se añadieron a 106 de sangre periférica de células mononucleares antes de su aislamiento de ácidos nucleicos. Esto corresponde de 1 a 106 por reacción ya que una décima parte de la nucleico aislado El ácido se utilizó como insumo para la anidada de reacción en cadena de polimerasa, que se realizó como se describe anteriormente. De la misma manera, nosotros prueba de la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa anidada ensayo descrito por Urisman et al8 utilizando GAG primer-I-R en lugar de GAG-I-R2.
Resultados
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Referencias
De ácido nucleico total fue aislado de mononucleares de sangre periférica las células de 32 pacientes y 43 controles sanos. El ácido nucleico se objeto de copia de la síntesis de ADN para aumentar la sensibilidad de nuestros ensayos de reacción en cadena de polimerasa. Esto se hizo porque hemos observado que el tiempo real de la polimerasa de ensayo de reacción en cadena sobre el ácido nucleico aislado de un cáncer de próstata XMRV positivo la línea celular, 22Rv1, y sometido a copiar la síntesis de ADN-que permite la detección del ADN y el ARN viral proviral-estaba a punto 10 veces más sensible que sin la síntesis de ADN copia (fig 1B). Sin embargo, todas las muestras de pacientes con fatiga crónica síndrome y de los controles dieron negativo para XMRV tanto la de la integrasa (gen de la figura 1) y el XMRV gag (gen de la figura 2).
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Fig. 1 Resultados de XMRV de la integrasa tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena. (A) Todos los 32 pacientes con síndrome de fatiga crónica (SFC), en comparación con el positivo 22Rv1 de control, que arrojó un valor de punto de cruce de alrededor de 23. Resultados de los controles de barrio no se muestran. (B) 22Rv1 total de ácidos nucleicos (ADN, sólidos), transcripción reversa de ácido nucleico total (ADNc, trazos). El paso adicional de transcripción inversa aumentó la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa, disminuyendo el punto de paso (Cp) por valor de 3,5. Uno de los tres experimentos independientes se muestra. (C) La sensibilidad de la prueba. La carátula muestra una relación lineal entre el número de moléculas de punta y valor del punto de cruce de 101 a 106 copias por reacción
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Fig. 2 Resultados de XMRV gag anidada en cadena polimerasa de reacción. (A) Resultados de 11 pacientes con síndrome de fatiga crónica y controles negativos. Resultados de los controles de barrio no se muestran. (1) El control dio positivo 22Rv1 un producto del tamaño esperado de 92 pares de bases (flecha), (2) negativa reacción de polimerasa en cadena de control; (3) el virus del distemper Focino (control interno), (4) la transcripción inversa control negativo; (5) - (11) y (13) - (16) muestras de los pacientes; (12) de control de aislamiento negativo; (M) 100 pares de base de marcador de tamaño. (B) La sensibilidad de la XMRV gag primera reacción en cadena de la polimerasa. (C) Sensibilidad de la reacción anidada. Las flechas blancas indican los 613 pares de bases (B) y 92 pares de bases (C) los productos de reacción. (1) 22Rv1; (2) negativa reacción de polimerasa en cadena de control; (3-9), serie de diluciones de 106 a 100 copias de calibrador por reacción; (10) de control de aislamiento negativo; (11) negativos anidados cadena de la polimerasa de control de reacción; (12) anidadas cadena de control positivo de reacción de la polimerasa (22Rv1); (m) 100 pares de base de marcador de tamaño. Flechas Negro 1-4 en (c) Indique los productos de la cadena de la polimerasa de reacción que se forman en la reacción anidada (véase D). (D) La posición de los gag cebadores y el gag los productos de la reacción en cadena de la polimerasa formado en la reacción anidada. Además de los iniciadores de la reacción anidada (GAG-SI, SI y gag-I-R2, I-R2), cebadores de la primera reacción (GAG-DE, DE y gag-O, O) también están presentes en la reacción anidada, los productos de reacción de la obtención de 1-4 que corresponden a las flechas en negro (C). Los números representan las posiciones sobre el genoma XMRV (VP42, DQ241302 adhesión [GenBank] )
Nuestra XMRV resultados negativos de la polimerasa de reacción en cadena es poco probable que se debe a pequeñas cantidades de ácido nucleico de prueba o de baja sensibilidad de los ensayos realizados. Se utilizó 50-300 ng de ácido nucleico total de de las células mononucleares de sangre periférica por cadena de la polimerasa la reacción, que es similar a la cantidad utilizada por Lombardi, et al.7 Por otra parte, mediante la adición de 10-diluciones de una definida cantidad de ADN molde a las células mononucleares de sangre periférica antes del aislamiento de ácidos nucleicos, hemos demostrado que tanto la tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena (Fig. 1C) y la anidada ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (Fig. 2B) podría detectar al menos 10 copias de XMRV por 105 células mononucleares de sangre periférica, lo que indica una alta sensibilidad. Una sensibilidad similar de la anidada cadena de polimerasa de reacción se observó cuando se utiliza los mismos cebadores descritos por Urisman et al (interior inversa GAG primer-IR en lugar del interior de GAG inversa primer-I-R2 utilizada en nuestro ensayo) (datos no mostrados).8
Nuestra XMRV resultados negativos de la polimerasa de reacción en cadena también poco probable que sea debido a problemas con el aislamiento de ácidos nucleicos, la pérdida de la integridad del ADN o ARN, la síntesis de ADN copia, o la procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa, ya que tanto la Focino el virus del moquillo ARN (un control interno de las cuales una cantidad fija fue agregado a cada una de las muestras antes de aislamiento de ácidos nucleicos) y la β-globina fueron amplificados de manera eficiente en todas las muestras analizadas (datos no mostrados).
Discusión
Resumen
Introducción
Métodos
Resultados
Discusión
Referencias
Principales conclusiones
Se evaluó la presencia de XMRV en mononucleares de sangre periférica células aisladas de pacientes con síndrome de fatiga crónica de una cohorte neerlandés bien caracterizado. No se encontraron pruebas para de la presencia de XMRV en cualquiera de estos casos esporádicos de enfermedades crónicas El síndrome de fatiga o en los controles.
Ventajas y limitaciones del estudio
Una limitación de nuestro estudio es que el número de pacientes y de los controles en nuestro estudio fueron relativamente pequeños. Con base en estos números bajos, el límite superior del 95% de confianza es una prevalencia de 9% para el grupo de pacientes y el 7% para el control de grupo, calculados de acuerdo a Eypasch et al (por la fórmula p = 3 / n).18 A pesar de que formalmente no se puede descartar un papel de XMRV, nuestros datos ponen en duda la afirmación de que está asociado este virus con síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes.
Comparación con los resultados de estudios previos
Los resultados del presente estudio están en contraste con los resultados de Lombardi, et al, que detectaron XMRV en el 67% de los pacientes con el síndrome de fatiga crónica analizados.7 Los aspectos técnicos se poco probable para explicar la diferencia en la tasa de positividad entre XMRV nuestros datos y sus datos. La posibilidad de que la relación de largo la duración del síndrome de fatiga crónica en nuestra cohorte puede tener condujo a los resultados negativos, parece poco probable, porque los retrovirus integrarse en el genoma del huésped. Dada la alta sensibilidad de nuestro tiempo real y anidados de reacción en cadena de polimerasa, una señal positiva que se han obtenido en la presencia del virus. El hecho de que nuestras muestras fueron criopreservados para muchos años es también poco probable que la cuenta de los resultados negativos. Las células mononucleares de sangre periférica criopreservado durante 12 años En estas condiciones se han mantenido viables y inmunocompetentes.13 Por otra parte, no encontramos ninguna diferencia en la eficiencia de la β-globina amplificación de genes de las muestras almacenadas en comparación con las muestras que se utilizaron directamente después de su aislamiento (datos no mostrados), indicando buena cantidad y calidad del ácido nucleico aislado de muestras de criopreservación.
Como los aspectos técnicos no parecen dar una explicación, la diferencia podría explicarse por las dos cohortes estudiadas. Nuestros pacientes cumplieron los criterios de Oxford para el síndrome de fatiga crónica, el mientras que los pacientes estudiados por Lombardi y col se registraron para cumplir los criterios de los Centros para el Control de Enfermedades,7 pero es poco probable para explicar la ausencia de XMRV en nuestros pacientes " muestras. Por desgracia, el papel de Lombardi y sus colegas carecían de una descripción clara de su cohorte de pacientes. Recientemente, en el Tri-Conferencia Anual de la Sociedad de 2009 en Lisboa, una presentación de informó de que se derivaron de la sangre periférica de células mononucleares de los pacientes del brote de síndrome de fatiga crónica en la aldea de inclinación en la frontera norte de Lake Tahoe, United Estados (1984-5).19 Este brote ha sido durante mucho tiempo pensaba que sido causado por una infección viral y se ha asociado con un número de virus, especialmente virus de Epstein-Barr20 y humanos el herpes virus 6,21 pero la evidencia firme para un papel de los virus en este brote en particular nunca ha sido proporcionada. Es posible de que el estudio de Lombardi y otros se derrumban la causa viral del brote de síndrome de fatiga crónica, pero parece poco probable que su estudio demuestra una asociación viral para esporádica casos de síndrome de fatiga crónica, como los que hemos probado, o de representa a la mayoría de los pacientes. Estudios de XMRV en casos esporádicos los casos de síndrome de fatiga crónica de los Estados Unidos ser de gran interés.
XMRV se identificó inicialmente en el tejido tumoral de alrededor de 10% de los pacientes con cáncer de próstata en los Estados Unidos.8 Esto asociación ha sido confirmado recientemente en otro estudio independiente de los Estados Unidos, en la que XMRV se detectó en el 23% de los los pacientes.9 Sorprendentemente, en tres cohortes europeas independientes de los pacientes con cáncer de próstata, no se detectaron XMRV.22 23 24 Si esta discrepancia se debe a diferencias geográficas en la la distribución del virus aún debe ser establecida.
Recientemente, un equipo del Reino Unido informó de la falta de para detectar XMRV en todas las 186 pruebas mononucleares de sangre periférica muestras de células de una cohorte bien caracterizada de pacientes británicos con el síndrome de fatiga crónica.25 Este equipo, sin embargo, no utilizar el mismo establece como primer utilizado por Lombardi et al, dejando abrir una posible explicación para la diferencia en los resultados. En nuestro estudio, hemos utilizado el mismo establece como primer utilizado por Lombardi et al. Aunque nuestro grupo de pacientes es relativamente pequeña y más Se requiere investigación adicional, nuestros hallazgos, junto con los de Erlwein et al25-Poner en duda la afirmación de que es XMRV asociados con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los los pacientes.
Lombardi et al XMRV También se detectó en aproximadamente el 4% de los controles sanos.7 No pudimos detectar XMRV en células mononucleares de sangre periférica de los controles sanos en nuestro estudio, pero el número de controles de prueba (n = 43) es demasiado baja para excluir la presencia de XMRV en de sangre en una parte de la población. Es evidente que, más investigación es necesarios para establecer la distribución de XMRV en los controles sanos y, por supuesto, en los productos de suministro de sangre en Europa y en el Estados Unidos.
Consecuencias
En conclusión, no hemos encontrado evidencia de un papel de XMRV en el causa del síndrome de fatiga crónica en pacientes neerlandés. En los últimas décadas hemos visto una serie de documentos antes de tiempo reclamando el descubrimiento de la causa microbiana de síndrome de fatiga crónica. Lamentablemente, hasta ahora ninguna de estas afirmaciones ha sido demostrada.
¿Qué se sabe sobre este tema
Síndrome de fatiga crónica es una enfermedad debilitante de causa desconocida que afecta a millones de de personas en todo el mundo
Un estudio de los Estados Unidos informó de la detección de los retrovirus de la leucemia murina xenotropic virus virus relacionado (XMRV) en células mononucleares de sangre periférica en una cohorte de pacientes con síndrome de fatiga crónica, lo que sugiere una posible relación causal y una explicación satisfactoria para sus problemas
Lo que este documento se añade
No se encontraron pruebas para la ocurrencia de XMRV en células mononucleares de sangre periférica de los pacientes con síndrome de fatiga crónica de una bien definida Cohorte neerlandés
Estos datos ponen en duda la afirmación de que es XMRV asociados con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes
Lo citan como: BMJ 2010; 340: C1018
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Colaboradores: FJMvK, GNM, JMDG, y JWMvdM diseñó el estudio y escribió el documento. ASdJ, KHL, GWV, y WJGM realizaron experimentos y analizó los datos. CMAS, GB, JMDG, y JWMvdM establecido el crónico síndrome de la fatiga de cohortes de pacientes. Todos los autores habían pleno acceso a todos los datos (incluidos los informes estadísticos y tablas) en el estudio y asumir la responsabilidad de la integridad de los datos y la exactitud de los análisis de datos. FJMvK y JWMvdM son los garantes del documento y aceptar la responsabilidad plena para el trabajo y / o la realización del estudio, tenían acceso a los datos, y controlar la decisión de publicar.
Financiación: Ninguna.
Conflicto de intereses: todos los autores han completado el Unificado de Competir en forma de intereses http://www.icmje.org" onclick="window.open(this.href);return false; / coi_disclosure.pdf (disponible a petición del autor correspondiente) y declarar de que ninguno de ellos (1) tiene el apoyo de las empresas presentadas para el trabajo; (2) tiene relaciones con empresas que podrían tener un el interés en el trabajo presentado en los últimos 3 años; (3) ha cónyuges, parejas o hijos que tienen relaciones financieras que pueden ser pertinentes para los trabajos presentados, y (4), no financiero intereses que pueden ser relevantes para el trabajo presentado.
La aprobación ética: aspectos éticos de este estudio fueron aprobados por la Onderzoek Mensgebonden Commissie de la Universidad de Radboud Centro Médico (OCM-1991).
El intercambio de datos: No hay información adicional disponible.
Referencias
lo único que sé, es que también a salido negativo para "XMRV" en el SFC.
Publicado el 25 de febrero de 2010, doi: 10.1136/bmj.c1018
Lo citan como: BMJ 2010; 340: C1018
Investigación
Prevalencia de xenotropic virus de la leucemia murina-virus relacionados en los pacientes con síndrome de fatiga crónica en los Países Bajos: análisis retrospectivo de muestras de una cohorte establecido
Frank J M van Kuppeveld, profesor asociado de la virología experimental de1, 5, 6, Arjan de Jong S, microbiólogo médico molecular1, 5, Kjerstin H Lanke, técnico de investigación1, 5, 6, Gerald W Verhaegh, investigador senior2, 6, Willem J G Melchers, microbiólogo médico molecular1, 5, 6, Caroline M A Swanink, microbiólogo médico1, Gijs Bleijenberg, profesor de psicología de4, 5, 7, Mihai G Netea, experimental, profesor de medicina interna3, 5, Jochem M D Galama, profesor de virología clínica1, 5, W M Jos van der Meer, profesor de medicina interna de3, 5
1 Departamento de Microbiología Médica, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 6500 HB Nijmegen, Países Bajos, 2 Departamento de Urología, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 3 Departamento de Medicina Interna, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 4 Centro de Expertos de Fatiga Crónica, Radboud University Nijmegen Medical Centre, 5 Nijmegen Instituto para la infección, la inflamación y la inmunidad, Nijmegen, 6 Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Nijmegen, 7 Nijmegen Centre for Evidence Based Practice, Nijmegen
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Objetivo La presencia del retrovirus de la leucemia murina xenotropic virus virus relacionado (XMRV) ha sido reportado en la sangre periférica las células mononucleares de pacientes con síndrome de fatiga crónica. Teniendo en cuenta la importancia médica y social potencialmente grande de tal descubrimiento, se investigó si este hallazgo puede ser confirmada en una cohorte europea independiente de los pacientes con El síndrome de fatiga crónica.
Diseñar Análisis de una cohorte bien definida de los pacientes y acertaron los controles del vecindario mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Escenario Certificado (ISO 15189) laboratorio de virología clínica en un hospital universitario en los Países Bajos.
Población Entre diciembre de 1991 y abril de 1992, periféricas células mononucleares de sangre fueron aisladas de 76 pacientes y 69 los controles del vecindario emparejado. En este estudio se probaron las células de 32 pacientes y 43 controles de quienes original criopreservados frascos estaban todavía disponibles.
Principales medidas de resultado Detección de XMRV en sangre periférica de células mononucleares de ensayo real del tiempo de reacción en cadena de la polimerasa la orientación de la XMRV de la integrasa genes y / o de la polimerasa anidada ensayo de reacción en cadena de la orientación de la XMRV gag gen.
Resultados No se detectaron XMRV secuencias en ninguno de los pacientes o los controles en ninguno de los ensayos, en la que positivo en la materia y los controles negativos de aislamiento y la reacción en cadena de la polimerasa controles. Experimentos con muestras enriquecidas mostraron que éramos capaz de detectar al menos 10 copias de secuencias de XMRV por 105 las células mononucleares de sangre periférica por el tiempo real, así como por anidada de reacción en cadena de la polimerasa, demostrando una alta sensibilidad de ambos ensayos.
Conclusiones Este estudio no pudo demostrar la presencia de XMRV en la células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedades crónicas El síndrome de fatiga de una cohorte neerlandés. Estos datos ponen en duda sobre la afirmación de que XMRV está asociada con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes.
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Referencias
Síndrome de fatiga crónica, también llamada encefalitis miálgica, es caracteriza por desactivar la fatiga física y mental, duradera durante al menos seis meses, sin una causa física aparente.1 2 3 El sello distintivo de la enfermedad es la fatiga debilitante, pero síntomas como mialgia, interrupción del sueño, dificultades de concentración, dolor de garganta, linfadenopatía y también pueden estar presentes, aunque de más variable. Más de dos tercios de los pacientes son mujeres. Aunque se desconoce la causa y la enfermedad puede abarcar más de un entidad, muchos han sugerido que los agentes infecciosos tienen un papel.4 De hecho, la aparición del síndrome de fatiga crónica es a menudo precedida por una gripe aguda como una enfermedad o la mononucleosis infecciosa, con aparentemente deterioro de recuperación.5 El papel de la infección crónica y la cambiado la inmunidad se ha postulado. La mayoría de los casos de la enfermedad son esporádicos, pero en algunos casos agrupados se han descrito, en particular, lo que sugiere una causa infecciosa. Sin embargo, a pesar de amplios estudios, ningún agente infeccioso causante ha sido concluyente identificados, ni un defecto inmunológico ha sido establecido para explicar los síntomas.2 6
En una publicación reciente en Ciencia, Lombardi, et al7 informó xenotropic la detección de virus de la leucemia murina-virus relacionado (XMRV)-gamma de un retrovirus humano que fue identificado por primera vez en el tejido tumoral de los pacientes con cáncer de próstata8En células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedades crónicas El síndrome de la fatiga. En ese estudio, XMRV fue detectado por la polimerasa de reacción en cadena en el 67% de los pacientes (68 de 101 muestras) y en el 4% de los individuos sanos (ocho de 213 muestras). Además, anticuerpos XMRV fueron identificados en la sangre de los pacientes pero no en los controles. Lombardi et al mostraron que XMRV era contagioso y de transmisión de material clínico de los pacientes a las células T las culturas y una línea celular permisiva. La secuencia genética de XMRV en los pacientes fue casi idéntica a la que en los pacientes con el cáncer de próstata, lo que indica que el retrovirus identificado es de un virus humano genuino en lugar de un ratón de contaminación de virus de la leucemia.
Este informe fue considerado un gran avance científico y llamó mucho la atención. Sin embargo, el documento quedó corto en la descripción de los pacientes: ¿Cuál fue la naturaleza de la cohorte, lo que fue la distribución por edad y sexo, que tan bien se los controles de la misma? De investigación de una cohorte independiente de tanto, es necesario antes de una asociación causal entre XMRV la infección y el desarrollo del síndrome de fatiga crónica puede determinarse. Se investigó la presencia de XMRV en la una cohorte neerlandés bien establecida de pacientes con fatiga crónica El síndrome de utilizar en tiempo real se ha descrito anteriormente y de la polimerasa anidada ensayos de reacción en cadena en dos genes diana diferente.7 8 9
Métodos
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Cohorte de pacientes
Todos los pacientes y los controles examinados en este estudio se parte de la de una cohorte de 298 pacientes neerlandés, que ha sido descrito en detalle.10 11 Todos los pacientes de esta cohorte cumplido el Oxford criterios e informó de fatiga intensa, sin explicación, debilitante de al menos un año de duración.12 La duración media de su los síntomas fue de siete años (rango 2-45 años). Los pacientes incluidos acudieron a la consulta ambulatoria en dos ocasiones en un período de tres meses. En la segunda visita, cada paciente fue acompañada por un barrio de control (que fue seleccionado por el paciente) del mismo sexo y el plazo de dos años de la misma edad. Los pacientes y los controles visitados nuestra clínica entre diciembre de 1991 y abril de 1992. Todos los pacientes realizó un examen físico y un laboratorio de amplio el trabajo y completado una serie de cuestionarios.10 Las muestras de sangre fueron obtenidos de 76 pacientes (seleccionados al azar utilizando una tabla de de números aleatorios10 De las 298 pacientes se describió anteriormente) y 69 controles de vecindad emparejado. Las muestras de sangre fueron enviadas a el laboratorio central del servicio de transfusión de sangre en Amsterdam, donde las células mononucleares de sangre periférica fueron aislados durante un estudio de los tipos de linfocitos y la apoptosis.11 Después del aislamiento, una fracción de las células mononucleares de sangre periférica fue directamente criopreservados de acuerdo con un protocolo estándar en un informático dispositivo. Las células fueron alícuotas en ampollas y se almacena con dimetil 10% sulfóxido a -196 º C (nitrógeno líquido) en una densidad de de alrededor de 107 células por ml. La calidad de las condiciones de almacenamiento en el laboratorio central del servicio de transfusión de sangre quedado ampliamente demostrado por Jansen et al, que demostró que periférica las células mononucleares de la sangre almacenada durante 12 años se mantuvo completamente viable e inmunológicamente competentes.13
En este estudio, se examinaron las células mononucleares de sangre periférica de todos los pacientes (n = 32) y controles (n = 43) de los cuales original viales criopreservados estaban todavía disponibles. Este grupo incluía 25 pacientes y sus controles de la misma, así como siete pacientes y 18 controles que no fueron comparados entre sí. El macho a razón hombre / mujer del grupo de pacientes que se ha probado en este estudio fue de 1:2. La media de edad de los pacientes de sexo masculino fue de 40,7 años (rango 25-61) y de las pacientes fue de 40,5 años (25-67).
El aislamiento de ácidos nucleicos y la síntesis de ADN copia
El ácido nucleico fue aislada a partir de 100 μl de sangre periférica de células mononucleares (alrededor de 0,5 a 2x106 las células) mediante la Magna-Pure LC y la Magna-Pure LC total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnóstico, Almere, Países Bajos), de acuerdo a las instrucciones de del fabricante y eluido en 50 μl de tampón de elución. Un importe fijo de virus del moquillo Focino, un paramixovirus que se utilizó como control interno, se añadieron a las muestras antes de el aislamiento de ácidos nucleicos para que podamos controlar la calidad del ARN y la posible inhibición de la amplificación de las muestras.14 ARN en el ácido nucleico total de los aislamientos se transcripción reversa para de copias de ADN utilizando el kit TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Países Bajos), en un 50 por mezcla de reacción μl con 20 μl de ácidos nucleicos ácido aislar (concentración de 25-150 ng por microlitro) y al azar hexámeros como cartillas, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena de
Un verdadero dúplex tiempo de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa se desarrolló, adaptación de la XMRV de la integrasa real de tiempo de reacción en cadena de la polimerasa ensayo descrito por Schlaberg et al,9 para detectar y XMRV Focino el virus del moquillo simultáneamente. La mezcla de reacción contenía 12,5 μl de 2X LightCycler 480 Sondas Master (Roche Diagnostics), 1 μM de cada primer y 400 Nm de cada sonda, y 5 μl de copias de ADN en un volumen de reacción de 25 microlitros. El XMRV y cebadores Focino virus de moquillo se como se describe.9 14 El XMRV la sonda fue utilizada como 5'-(6-carboxifluoresceína)-etiquetados, bloqueado nucleico sonda de hidrólisis ácida y el virus del moquillo Focino la sonda fue utilizada como 5'-amarillo Yakima-etiquetado, bloqueado nucleicos Sonda de hidrólisis ácida. Todos los primers y sondas utilizadas en este estudio se muestran en la tabla. Condiciones de Ciclismo fueron 95 ° C de cinco minutos, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, y 60 ° C durante 45 segundos utilizando el instrumento LightCycler 480 (Roche Diagnostics). El resultado de la muestra se consideró un resultado válido sólo si el valor del punto de cruce de la aguja el virus del distemper Focino estaba dentro de dos ciclos de la media de de las muestras sin inhibiciones.
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Secuencias de primers y sondas utilizadas en este estudio
Controles positivos y negativos para el aislamiento, la transcripción inversa, y la reacción en cadena de la polimerasa fueron incluidos en cada serie. β-globina real de tiempo de reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo utilizando los cebadores y las sondas de hibridación como se describe.15 Media punto de cruce valor de β-globina tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena de fue 23,84, desviación estándar de 0,95. Como control positivo para el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa, se utilizó el ácido nucleico aislada de 22Rv1, una línea celular de carcinoma de próstata (American Type Culture Colección número CRL-2505) que ha sido recientemente demostrado que contienen múltiples copias integrado de XMRV y producir altos niveles del virus infeccioso.16 Total de aislamiento de ácidos nucleicos y de la muestra la preparación de esta línea celular fue como se describe más arriba para periféricos células mononucleares de sangre.
Para determinar la sensibilidad de la época XMRV real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena, hemos generado a 192 pares de bases XMRV de la integrasa producto de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores XMRV-F2 (que se encuentra aguas arriba de XMRV-F1) y XMRV-R3 (que se encuentra aguas abajo de XMRV-R2), y 22Rv1 de copias de ADN como molde. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa se purificó mediante el Asistente para PCR preps sistema de purificación de ADN (Promega Benelux, Leiden, Países Bajos). La concentración se determinó mediante un Nanodrop 1000 (Thermo Scientific / Isogen, De Meern, Países Bajos) y el número de copias por μl fue calculado. Una serie de diluciones se hizo en el que 101 a 107 copias del calibrador se han añadido a 106 las células mononucleares de sangre periférica antes de ácido nucleico de aislamiento. Esto corresponde a 1 a 106 copias por reacción, ya que una décima parte del ácido nucleico aislada se utilizan como materia prima de la reacción en cadena de la polimerasa, que se realiza como se describe por encima de.
Anidados de reacción en cadena polimerasa
El XMRV gag anidada en cadena polimerasa reacción fue adaptado de Urisman et al.8 Las mezclas de reacción contenía 25 μl de 2X PCR Master (Roche Diagnostics), y 200 nM de cada cebador en un volumen de reacción de 50 microlitros. En la primera reacción, 5 μl de ADN copia se utilizó. Posteriormente, 5 μl de La primera reacción fue utilizada como insumo para la reacción anidada. Cebadores fueron descritas, excepto por el primer revés de la reacción anidada (GAG-IR), que fue sustituido por GAG-I-R2 para producir un producto de 92 pares de base de la reacción (que usamos GAG primer-I-R2 porque se produce menos de fondo en la transcripción inversa anidadas la reacción en cadena de la polimerasa). La secuencia diana de GAG-I-R2 es 100% conserva entre todos los XMRV aislados publicados hasta la fecha (datos no mostrados). Las condiciones de Ciclismo se como se describió anteriormente.8 Productos de la reacción en cadena de la polimerasa (20 microlitro) se analizaron en un 2,5% gel de agarosa.
Para determinar la sensibilidad de nuestra cadena de la polimerasa anidada XMRV ensayo de reacción, 708 pares de bases XMRV gag la reacción en cadena de la polimerasa producto generado utilizando cebadores GAG-UNIQ-F descrito por Dong et al17 (que se encuentra aguas arriba de GAG-DE) y gag-O, y 22Rv1 de copias de ADN como molde. Purificación y determinación de la cantidad de producto de la reacción en cadena de la polimerasa se realizarán según lo descrito anteriormente para la cadena de la polimerasa en tiempo real calibrador de reacción. Una serie de dilución se hizo y el 10 de1 a 107 copias del calibrador se añadieron a 106 de sangre periférica de células mononucleares antes de su aislamiento de ácidos nucleicos. Esto corresponde de 1 a 106 por reacción ya que una décima parte de la nucleico aislado El ácido se utilizó como insumo para la anidada de reacción en cadena de polimerasa, que se realizó como se describe anteriormente. De la misma manera, nosotros prueba de la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa anidada ensayo descrito por Urisman et al8 utilizando GAG primer-I-R en lugar de GAG-I-R2.
Resultados
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De ácido nucleico total fue aislado de mononucleares de sangre periférica las células de 32 pacientes y 43 controles sanos. El ácido nucleico se objeto de copia de la síntesis de ADN para aumentar la sensibilidad de nuestros ensayos de reacción en cadena de polimerasa. Esto se hizo porque hemos observado que el tiempo real de la polimerasa de ensayo de reacción en cadena sobre el ácido nucleico aislado de un cáncer de próstata XMRV positivo la línea celular, 22Rv1, y sometido a copiar la síntesis de ADN-que permite la detección del ADN y el ARN viral proviral-estaba a punto 10 veces más sensible que sin la síntesis de ADN copia (fig 1B). Sin embargo, todas las muestras de pacientes con fatiga crónica síndrome y de los controles dieron negativo para XMRV tanto la de la integrasa (gen de la figura 1) y el XMRV gag (gen de la figura 2).
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Fig. 1 Resultados de XMRV de la integrasa tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena. (A) Todos los 32 pacientes con síndrome de fatiga crónica (SFC), en comparación con el positivo 22Rv1 de control, que arrojó un valor de punto de cruce de alrededor de 23. Resultados de los controles de barrio no se muestran. (B) 22Rv1 total de ácidos nucleicos (ADN, sólidos), transcripción reversa de ácido nucleico total (ADNc, trazos). El paso adicional de transcripción inversa aumentó la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa, disminuyendo el punto de paso (Cp) por valor de 3,5. Uno de los tres experimentos independientes se muestra. (C) La sensibilidad de la prueba. La carátula muestra una relación lineal entre el número de moléculas de punta y valor del punto de cruce de 101 a 106 copias por reacción
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Fig. 2 Resultados de XMRV gag anidada en cadena polimerasa de reacción. (A) Resultados de 11 pacientes con síndrome de fatiga crónica y controles negativos. Resultados de los controles de barrio no se muestran. (1) El control dio positivo 22Rv1 un producto del tamaño esperado de 92 pares de bases (flecha), (2) negativa reacción de polimerasa en cadena de control; (3) el virus del distemper Focino (control interno), (4) la transcripción inversa control negativo; (5) - (11) y (13) - (16) muestras de los pacientes; (12) de control de aislamiento negativo; (M) 100 pares de base de marcador de tamaño. (B) La sensibilidad de la XMRV gag primera reacción en cadena de la polimerasa. (C) Sensibilidad de la reacción anidada. Las flechas blancas indican los 613 pares de bases (B) y 92 pares de bases (C) los productos de reacción. (1) 22Rv1; (2) negativa reacción de polimerasa en cadena de control; (3-9), serie de diluciones de 106 a 100 copias de calibrador por reacción; (10) de control de aislamiento negativo; (11) negativos anidados cadena de la polimerasa de control de reacción; (12) anidadas cadena de control positivo de reacción de la polimerasa (22Rv1); (m) 100 pares de base de marcador de tamaño. Flechas Negro 1-4 en (c) Indique los productos de la cadena de la polimerasa de reacción que se forman en la reacción anidada (véase D). (D) La posición de los gag cebadores y el gag los productos de la reacción en cadena de la polimerasa formado en la reacción anidada. Además de los iniciadores de la reacción anidada (GAG-SI, SI y gag-I-R2, I-R2), cebadores de la primera reacción (GAG-DE, DE y gag-O, O) también están presentes en la reacción anidada, los productos de reacción de la obtención de 1-4 que corresponden a las flechas en negro (C). Los números representan las posiciones sobre el genoma XMRV (VP42, DQ241302 adhesión [GenBank] )
Nuestra XMRV resultados negativos de la polimerasa de reacción en cadena es poco probable que se debe a pequeñas cantidades de ácido nucleico de prueba o de baja sensibilidad de los ensayos realizados. Se utilizó 50-300 ng de ácido nucleico total de de las células mononucleares de sangre periférica por cadena de la polimerasa la reacción, que es similar a la cantidad utilizada por Lombardi, et al.7 Por otra parte, mediante la adición de 10-diluciones de una definida cantidad de ADN molde a las células mononucleares de sangre periférica antes del aislamiento de ácidos nucleicos, hemos demostrado que tanto la tiempo real de la polimerasa ensayo de reacción en cadena (Fig. 1C) y la anidada ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (Fig. 2B) podría detectar al menos 10 copias de XMRV por 105 células mononucleares de sangre periférica, lo que indica una alta sensibilidad. Una sensibilidad similar de la anidada cadena de polimerasa de reacción se observó cuando se utiliza los mismos cebadores descritos por Urisman et al (interior inversa GAG primer-IR en lugar del interior de GAG inversa primer-I-R2 utilizada en nuestro ensayo) (datos no mostrados).8
Nuestra XMRV resultados negativos de la polimerasa de reacción en cadena también poco probable que sea debido a problemas con el aislamiento de ácidos nucleicos, la pérdida de la integridad del ADN o ARN, la síntesis de ADN copia, o la procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa, ya que tanto la Focino el virus del moquillo ARN (un control interno de las cuales una cantidad fija fue agregado a cada una de las muestras antes de aislamiento de ácidos nucleicos) y la β-globina fueron amplificados de manera eficiente en todas las muestras analizadas (datos no mostrados).
Discusión
Resumen
Introducción
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Resultados
Discusión
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Principales conclusiones
Se evaluó la presencia de XMRV en mononucleares de sangre periférica células aisladas de pacientes con síndrome de fatiga crónica de una cohorte neerlandés bien caracterizado. No se encontraron pruebas para de la presencia de XMRV en cualquiera de estos casos esporádicos de enfermedades crónicas El síndrome de fatiga o en los controles.
Ventajas y limitaciones del estudio
Una limitación de nuestro estudio es que el número de pacientes y de los controles en nuestro estudio fueron relativamente pequeños. Con base en estos números bajos, el límite superior del 95% de confianza es una prevalencia de 9% para el grupo de pacientes y el 7% para el control de grupo, calculados de acuerdo a Eypasch et al (por la fórmula p = 3 / n).18 A pesar de que formalmente no se puede descartar un papel de XMRV, nuestros datos ponen en duda la afirmación de que está asociado este virus con síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes.
Comparación con los resultados de estudios previos
Los resultados del presente estudio están en contraste con los resultados de Lombardi, et al, que detectaron XMRV en el 67% de los pacientes con el síndrome de fatiga crónica analizados.7 Los aspectos técnicos se poco probable para explicar la diferencia en la tasa de positividad entre XMRV nuestros datos y sus datos. La posibilidad de que la relación de largo la duración del síndrome de fatiga crónica en nuestra cohorte puede tener condujo a los resultados negativos, parece poco probable, porque los retrovirus integrarse en el genoma del huésped. Dada la alta sensibilidad de nuestro tiempo real y anidados de reacción en cadena de polimerasa, una señal positiva que se han obtenido en la presencia del virus. El hecho de que nuestras muestras fueron criopreservados para muchos años es también poco probable que la cuenta de los resultados negativos. Las células mononucleares de sangre periférica criopreservado durante 12 años En estas condiciones se han mantenido viables y inmunocompetentes.13 Por otra parte, no encontramos ninguna diferencia en la eficiencia de la β-globina amplificación de genes de las muestras almacenadas en comparación con las muestras que se utilizaron directamente después de su aislamiento (datos no mostrados), indicando buena cantidad y calidad del ácido nucleico aislado de muestras de criopreservación.
Como los aspectos técnicos no parecen dar una explicación, la diferencia podría explicarse por las dos cohortes estudiadas. Nuestros pacientes cumplieron los criterios de Oxford para el síndrome de fatiga crónica, el mientras que los pacientes estudiados por Lombardi y col se registraron para cumplir los criterios de los Centros para el Control de Enfermedades,7 pero es poco probable para explicar la ausencia de XMRV en nuestros pacientes " muestras. Por desgracia, el papel de Lombardi y sus colegas carecían de una descripción clara de su cohorte de pacientes. Recientemente, en el Tri-Conferencia Anual de la Sociedad de 2009 en Lisboa, una presentación de informó de que se derivaron de la sangre periférica de células mononucleares de los pacientes del brote de síndrome de fatiga crónica en la aldea de inclinación en la frontera norte de Lake Tahoe, United Estados (1984-5).19 Este brote ha sido durante mucho tiempo pensaba que sido causado por una infección viral y se ha asociado con un número de virus, especialmente virus de Epstein-Barr20 y humanos el herpes virus 6,21 pero la evidencia firme para un papel de los virus en este brote en particular nunca ha sido proporcionada. Es posible de que el estudio de Lombardi y otros se derrumban la causa viral del brote de síndrome de fatiga crónica, pero parece poco probable que su estudio demuestra una asociación viral para esporádica casos de síndrome de fatiga crónica, como los que hemos probado, o de representa a la mayoría de los pacientes. Estudios de XMRV en casos esporádicos los casos de síndrome de fatiga crónica de los Estados Unidos ser de gran interés.
XMRV se identificó inicialmente en el tejido tumoral de alrededor de 10% de los pacientes con cáncer de próstata en los Estados Unidos.8 Esto asociación ha sido confirmado recientemente en otro estudio independiente de los Estados Unidos, en la que XMRV se detectó en el 23% de los los pacientes.9 Sorprendentemente, en tres cohortes europeas independientes de los pacientes con cáncer de próstata, no se detectaron XMRV.22 23 24 Si esta discrepancia se debe a diferencias geográficas en la la distribución del virus aún debe ser establecida.
Recientemente, un equipo del Reino Unido informó de la falta de para detectar XMRV en todas las 186 pruebas mononucleares de sangre periférica muestras de células de una cohorte bien caracterizada de pacientes británicos con el síndrome de fatiga crónica.25 Este equipo, sin embargo, no utilizar el mismo establece como primer utilizado por Lombardi et al, dejando abrir una posible explicación para la diferencia en los resultados. En nuestro estudio, hemos utilizado el mismo establece como primer utilizado por Lombardi et al. Aunque nuestro grupo de pacientes es relativamente pequeña y más Se requiere investigación adicional, nuestros hallazgos, junto con los de Erlwein et al25-Poner en duda la afirmación de que es XMRV asociados con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los los pacientes.
Lombardi et al XMRV También se detectó en aproximadamente el 4% de los controles sanos.7 No pudimos detectar XMRV en células mononucleares de sangre periférica de los controles sanos en nuestro estudio, pero el número de controles de prueba (n = 43) es demasiado baja para excluir la presencia de XMRV en de sangre en una parte de la población. Es evidente que, más investigación es necesarios para establecer la distribución de XMRV en los controles sanos y, por supuesto, en los productos de suministro de sangre en Europa y en el Estados Unidos.
Consecuencias
En conclusión, no hemos encontrado evidencia de un papel de XMRV en el causa del síndrome de fatiga crónica en pacientes neerlandés. En los últimas décadas hemos visto una serie de documentos antes de tiempo reclamando el descubrimiento de la causa microbiana de síndrome de fatiga crónica. Lamentablemente, hasta ahora ninguna de estas afirmaciones ha sido demostrada.
¿Qué se sabe sobre este tema
Síndrome de fatiga crónica es una enfermedad debilitante de causa desconocida que afecta a millones de de personas en todo el mundo
Un estudio de los Estados Unidos informó de la detección de los retrovirus de la leucemia murina xenotropic virus virus relacionado (XMRV) en células mononucleares de sangre periférica en una cohorte de pacientes con síndrome de fatiga crónica, lo que sugiere una posible relación causal y una explicación satisfactoria para sus problemas
Lo que este documento se añade
No se encontraron pruebas para la ocurrencia de XMRV en células mononucleares de sangre periférica de los pacientes con síndrome de fatiga crónica de una bien definida Cohorte neerlandés
Estos datos ponen en duda la afirmación de que es XMRV asociados con el síndrome de fatiga crónica en la mayoría de los pacientes
Lo citan como: BMJ 2010; 340: C1018
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Colaboradores: FJMvK, GNM, JMDG, y JWMvdM diseñó el estudio y escribió el documento. ASdJ, KHL, GWV, y WJGM realizaron experimentos y analizó los datos. CMAS, GB, JMDG, y JWMvdM establecido el crónico síndrome de la fatiga de cohortes de pacientes. Todos los autores habían pleno acceso a todos los datos (incluidos los informes estadísticos y tablas) en el estudio y asumir la responsabilidad de la integridad de los datos y la exactitud de los análisis de datos. FJMvK y JWMvdM son los garantes del documento y aceptar la responsabilidad plena para el trabajo y / o la realización del estudio, tenían acceso a los datos, y controlar la decisión de publicar.
Financiación: Ninguna.
Conflicto de intereses: todos los autores han completado el Unificado de Competir en forma de intereses http://www.icmje.org" onclick="window.open(this.href);return false; / coi_disclosure.pdf (disponible a petición del autor correspondiente) y declarar de que ninguno de ellos (1) tiene el apoyo de las empresas presentadas para el trabajo; (2) tiene relaciones con empresas que podrían tener un el interés en el trabajo presentado en los últimos 3 años; (3) ha cónyuges, parejas o hijos que tienen relaciones financieras que pueden ser pertinentes para los trabajos presentados, y (4), no financiero intereses que pueden ser relevantes para el trabajo presentado.
La aprobación ética: aspectos éticos de este estudio fueron aprobados por la Onderzoek Mensgebonden Commissie de la Universidad de Radboud Centro Médico (OCM-1991).
El intercambio de datos: No hay información adicional disponible.
Referencias
